Comprender las interacciones entre patógenos vegetales mediante el uso espacial y único.

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 814 (2023) Citar este artículo

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Las plantas están en contacto con diversos patógenos y microorganismos. La intensa investigación realizada durante los últimos 30 años ha dado como resultado la identificación de múltiples receptores inmunes en especies modelo y de cultivos, así como la superposición de señales en receptores inmunes intracelulares y localizados en la superficie. Sin embargo, los científicos todavía tienen una comprensión limitada de cómo las plantas responden a diversos patógenos con resolución espacial y celular. Los avances recientes en tecnologías unicelulares, uninucleares y espaciales ahora se pueden aplicar a las interacciones entre plantas y patógenos. Aquí, describimos el estado actual de estas tecnologías y destacamos cuestiones biológicas pendientes que pueden abordarse en el futuro.

Las plantas pueden ser infectadas por diversos organismos patógenos que modulan las células huésped para permitir su crecimiento y diseminación. Los patógenos implementan una variedad de estrategias de manipulación que pueden variar durante el curso de la infección. Estas estrategias incluyen la supresión de las defensas de las plantas, así como el despliegue de toxinas y enzimas degradativas para facilitar la colonización y la liberación de nutrientes1. Algunos patógenos pueden penetrar e invadir directamente los tejidos de las plantas, mientras que otros ingresan a través de heridas o aberturas naturales. Los patógenos transmitidos por vectores pueden ser introducidos directamente en los tejidos vasculares por diferentes grupos de insectos chupadores y perforadores. Cada mecanismo de invasión tisular pone al patógeno en contacto con diferentes tipos de células y tejidos1,2,3.

En una hoja se observan simultáneamente distintas etapas de infección por patógenos4. La distribución de patógenos en las plantas no es homogénea, generando un desarrollo desigual de los síntomas5,6,7. La mayoría de los estudios previos que investigaron las interacciones entre plantas y patógenos se llevaron a cabo utilizando plantas enteras o tipos de tejidos complejos. Existen diferencias significativas entre las respuestas unicelulares y de tejido completo, lo que sugiere que la respuesta observada a nivel tisular es un promedio de las oscilaciones que ocurren entre las células dirigidas a patógenos y las no dirigidas8. Los avances tecnológicos recientes permiten a los científicos investigar las respuestas de plantas y patógenos con resolución unicelular o en un contexto espacial9,10,11. Estos avances facilitarán una comprensión más holística de las respuestas celulares y la variabilidad dentro de un tejido.

Las plantas poseen un sistema inmunológico innato, que consta de receptores de reconocimiento de patrones (PRR) localizados en la superficie y receptores intracelulares de repetición ricos en leucina (NLR) de unión a nucleótidos12. Los PRR pueden reconocer patrones moleculares conservados asociados a microbios y daños (MAMP y DAMP, respectivamente), lo que da como resultado inmunidad desencadenada por PRR (PTI). Los receptores inmunes NLR de las plantas reconocen efectores de patógenos secretados dentro de las células, induciendo inmunidad activada por efectores (ETI)12. Aunque los PRR y los NLR son estructuralmente distintos y pueden reconocer diferentes componentes patógenos, comparten una superposición significativa en la señalización posterior, como las cascadas de proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), el flujo de calcio, una explosión de especies reactivas de oxígeno (ROS), la reprogramación transcripcional, y señalización de fitohormonas13. Recientemente, se demostró que PTI y ETI se potencian mutuamente para mediar una resistencia sólida14,15. Los avances en las tecnologías espaciales y unicelulares tienen el potencial de dilucidar las respuestas celulares en células adyacentes y dirigidas a patógenos.

Aunque la señalización inmunitaria se ha estudiado ampliamente, los científicos aún no comprenden la expresión espacial de los receptores inmunitarios en diversos tejidos vegetales. Durante muchos años, asumimos que todas las células vegetales eran inmunocompetentes. Recientemente, se ha demostrado que sólo un subconjunto restringido de zonas de raíces de Arabidopsis responde directamente a la flagelina MAMP en ausencia de daño16,17. Es necesaria una caracterización detallada de la respuesta de las células vegetales competentes durante el proceso de infección para comprender los mecanismos que regulan la progresión de la enfermedad.

Aquí, discutimos los desafíos y el potencial de estudiar las interacciones patógeno-planta desde un punto de vista espacial y unicelular. Primero, presentamos brevemente el estado actual de las tecnologías espaciales y unicelulares. A continuación, nos sumergimos en cómo se pueden utilizar estas tecnologías para abordar cuestiones biológicas pendientes.

Los estudios a nivel de tejidos u órganos han avanzado en nuestra comprensión de la percepción de patógenos y la señalización de las plantas en interacciones compatibles (susceptibles) e incompatibles (inmunitarias o no huésped)12,18,19. Sin embargo, todavía quedan muchas preguntas importantes. ¿Cómo responden los diferentes tipos de células vegetales a la infección por patógenos? ¿Cómo se comunican las células atacadas por patógenos con sus vecinas? ¿Qué transcripciones, proteínas y metabolitos están enmascarados en los análisis masivos pero desempeñan funciones esenciales durante las interacciones entre plantas y patógenos? Los avances recientes en análisis espaciales y unicelulares facilitan la investigación de estas preguntas fundamentales9,10,11,20,21,22,23.

La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) permite elaborar perfiles de expresión génica en células individuales22,24,25,26. scRNA-seq se desarrolló por primera vez para analizar el transcriptoma celular de un solo blastómero de ratón27. En 2012, esta tecnología se utilizó para perfilar cientos de células; en 2015, se logró el perfil transcripcional de 44.808 células de ratón28,29. En 2016, se adoptó scRNA-seq para el tejido de raíces de plantas30. Desde entonces, esta tecnología se ha utilizado para comprender el desarrollo de las plantas y su aclimatación a entornos cambiantes22,31,32.

La tecnología scRNA-seq más utilizada está basada en gotas, que combina microfluidos con códigos de barras para permitir la elaboración de perfiles transcriptomas paralelos y de alto rendimiento de células individuales (inDrop, Drop-seq y 10× Genomics; Fig. 1)22,25. 29. Una célula vegetal consta de transcripciones tanto en el citoplasma como en el núcleo. La vida media de una transcripción puede ser de hasta 24h33. Por tanto, el transcriptoma celular puede capturar la expresión génica con el tiempo. RNA-seq se puede realizar con núcleos (snRNA-seq) o células individuales aisladas (scRNA-seq). En Arabidopsis, el 14% del total de genes exhibió expresión diferencial entre estos dos métodos34. snRNA-seq detectó menos transcripciones que scRNA-seq, pero aún así perfiló aproximadamente el 90% del total de transcripciones detectadas en scRNA-seq. Una ventaja de snRNA-seq es que este enfoque permite perfilar células que son difíciles de digerir enzimáticamente. En general, tanto snRNA-seq como scRNA-seq exhiben una alta correlación con RNA-seq en masa (r = 0,7–0,8) y reflejan el patrón de expresión en tejido intacto34. Para snRNA-seq, los núcleos se pueden aislar utilizando una variedad de enfoques en tejido fresco o congelado35,36,37. Para scRNA-seq, las células individuales se aíslan mediante digestión enzimática de tejidos vegetales (Fig. 1)22. El proceso de protoplastificación da como resultado cambios transcripcionales, que también pueden afectar las transcripciones de una manera específica del tipo de célula o del estado38,39. Por lo tanto, es esencial incluir secuencias de ARN en masa de todo el tejido como control para excluir genes afectados por el proceso de protoplastia. A continuación, las células aisladas se separan y se encapsulan en gotitas con perlas con códigos de barras utilizando microfluidos. Posteriormente, dentro de las gotitas se produce la lisis celular y la codificación de barras del ADNc. Finalmente, las transcripciones se secuencian en paralelo en la plataforma Illumina y se demultiplexan (Fig. 1)22,26.

Para scRNA-seq, las células individuales se aíslan mediante digestión enzimática del tejido intacto para generar protoplastos. Los microfluidos se utilizan para separar y encapsular protoplastos individuales en gotas con perlas con códigos de barras. Cada perla con código de barras está recubierta con sondas de ADN, que contienen poli (dT) para capturar ARNm, un identificador molecular único (UMI) y un código de barras específico de la célula. Luego se produce la lisis celular y los ARNm se hibridan con sondas y se transcriben de forma inversa en perlas dentro de gotitas. Finalmente, se secuencia una biblioteca de ADNc con código de barras de miles de células individuales para generar transcriptomas unicelulares. Para la transcriptómica espacial, se secciona tejido vegetal recién congelado en un portaobjetos de transcriptómica espacial. Las zonas de captura de la diapositiva contienen miles de puntos. Cada punto consta de sondas que contienen un código de barras espacial único, un identificador molecular único (UMI) y una región poli (dT) para capturar transcripciones. Las transcripciones se liberan mediante permeabilización, se hibridan con sondas y se transcriben de forma inversa para incorporar códigos de barras espaciales. Los ADNc generados que contienen información espacial se escinden del portaobjetos y se utilizan para preparar una biblioteca para la secuenciación. Las lecturas secuenciadas se asignan espacialmente en función de códigos de barras espaciales. Creado con BioRender.com.

Además de los métodos basados en gotas, los métodos basados en placas normalmente se combinan con la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para clasificar las células de interés en pocillos individuales en una placa22,24,25. FACS es un método bien establecido que se utiliza junto con líneas indicadoras fluorescentes para capturar grupos específicos de células. Por ejemplo, FACS se ha utilizado para clasificar tipos específicos de células de raíz y floema que luego se analizaron mediante scRNA-seq40. Si bien los métodos basados en placas tienen un menor número de células perfiladas, tienen la mayor sensibilidad para estudiar transcripciones raras o tejidos limitados22,24. La microdisección por captura láser es otro método para capturar decenas o cientos de células bajo visualización microscópica directa41. Los avances recientes en estrategias combinatorias de códigos de barras (SPLiT-seq y sci-RNA-seq) permiten la elaboración de perfiles transcriptómicos a partir de un número exponencialmente escalable de células o núcleos individuales42,43,44.

La disociación del tejido es necesaria para el aislamiento de una sola célula, pero produce daño y pérdida de contenido espacial dentro de un tejido, lo cual es fundamental para comprender la función celular20. La transcriptómica espacial (ST) se desarrolló para preservar la información espacial y al mismo tiempo perfilar la expresión de genes celulares en alta resolución. ST incluye métodos basados en hibridación in situ fluorescente (FISH) y basados en manchas. La ST basada en puntos utiliza códigos de barras específicos de puntos anclados en una matriz para capturar y etiquetar ARNm de criosecciones de tejido (Fig. 1)21,45. Esto se ha comercializado y aplicado en tejidos humanos/animales con resolución unicelular46. Recientemente, la ST basada en manchas se ha extendido a tejidos vegetales, incluidos los brotes de las hojas de Populus tremula, los conos de Arabidopsis y Picea abies9,21,37,47. Para la tecnología de transcriptómica espacial Visium (10× Genomics), la distancia de centro a centro entre puntos vecinos es de 100 µm, que es mayor que el tamaño promedio de una sola célula vegetal (10–100 µm)21,45. La mayor distancia entre puntos disminuirá la resolución de una sola pieza de tejido, pero en última instancia podría compensarse incluyendo áreas de captura adicionales. Otra tecnología ST basada en manchas, Stereo-seq, se ha aplicado a las hojas de Arabidopsis. Stereo-seq acopla una nanobola como punto, lo que reduce significativamente la distancia entre puntos vecinos a 500 nm47. Además de los métodos basados en manchas, los ST basados en FISH se han utilizado en la investigación de plantas11,37. Por ejemplo, la observación dirigida del mapa de expresión génica basada en hibridación de plantas (PHYTOMap) se desarrolló para resolver espacialmente la expresión de docenas de genes a nivel unicelular en tejido de raíz de Arabidopsis completo11. PHYTOMap es más asequible que las plataformas transcriptómicas espaciales disponibles comercialmente, como Molecular Cartography (Resolve Biosciences) y MERSCOPE (Vizgen).

Los enfoques transcriptómicos permiten a los investigadores analizar los cambios celulares indirectamente, pero los perfiles proteómicos y metabólicos proporcionan una caracterización más directa del resultado funcional de una célula48. Los avances en las tecnologías espaciales y unicelulares para caracterizar los estados proteómicos y metabólicos no son tan avanzados como los análisis transcriptómicos debido a desafíos técnicos48,49,50. Los desafíos técnicos impuestos por la naturaleza de los metabolitos y las proteínas incluyen: diferentes químicas requeridas para diferentes tipos de analitos, diversas proteínas y metabolitos con abundancia variada y la capacidad de los metabolitos para escaparse de las células. Además, el límite de detección para la cuantificación de proteínas y metabolitos suele ser mayor que para el perfil transcripcional y la identificación de metabolitos depende de la presencia de una biblioteca de compuestos conocidos51. Recientemente, se utilizaron análisis de proteoma resueltos espacialmente mediante microdisección de captura láser junto con muestreo basado en nanogotas para perfilar proteínas de ~8 a 15 células del parénquima del pericarpio del fruto del tomate, pero se limitaron a ~400 proteínas52,53. La metabolómica espacial ha permitido perfilar un único nódulo de raíz de soja inoculado con Bradyrhizobium japonicum10. Las imágenes de espectrometría de masas pueden resolver la distribución espacial y la cuantificación de metabolitos vegetales específicos con una resolución tan alta como unicelular54,55.

Los patógenos vegetales emplean una amplia variedad de estrategias de invasión y pueden colonizar diferentes tipos de tejidos. La mayoría de las investigaciones se han centrado en la invasión de las hojas a través de estomas abiertos y heridas o por penetración directa de la epidermis de la hoja1,19. Sin embargo, varios patógenos bacterianos, fúngicos y virales devastadores pueden invadir el tejido vascular2,3,56. Por ejemplo, los patógenos transmitidos por el suelo frecuentemente colonizan el xilema y deben navegar por múltiples tipos de células en la raíz para llegar al sistema vascular57. Los científicos todavía tienen un conocimiento deficiente de los tipos de células específicas que son manipuladas por los patógenos y de cómo estas células pueden responder a la infección por patógenos.

Si bien las raíces son competentes en materia de señalización inmunitaria, diferentes zonas dentro de la raíz responden de manera diferente a los MAMP o a la infección por patógenos58,59,60,61,62. Utilizando líneas indicadoras fluorescentes para genes marcadores inmunes y un receptor PRR, las capas de células externas diferenciadas en la raíz de Arabidopsis muestran una sensibilidad MAMP disminuida hasta que encuentran daño, lo que aumenta localmente la capacidad de respuesta inmune16,17. Estas respuestas de raíces espacialmente restringidas pueden deberse a la prevalencia de comunidades microbianas en la rizosfera17. Los análisis de RNA-seq también revelaron que la expresión del gen NLR varía entre órganos de manera específica de cada especie63. Un estudio reciente generó un atlas transcriptoma de Arabidopsis de semilla a semilla que abarca todos los órganos principales utilizando snRNA-seq37. Este importante recurso se puede utilizar para consultar la expresión de PRR, NLR y redes de señalización inmunitaria para obtener una mayor comprensión de la regulación de la competencia inmunitaria específica del tejido y del desarrollo.

La capacidad de perfilar la respuesta a la infección por patógenos con resolución espacial y celular dará como resultado una comprensión más holística de cómo responden las plantas a diversos patógenos. ¿Qué tipos de células son inmunes? ¿Cómo cambia la señalización celular según el tipo de célula y tejido? Las respuestas inmunes no pueden entenderse completamente sin considerar el papel de los diferentes tipos de células, la edad de la planta y la etapa de desarrollo. Los científicos han comenzado a revelar diferentes estados inmunológicos en diferentes tipos de células utilizando una combinación de sc/snRNA-seq junto con un mapeo espacial de transcripciones basado en FISH64,65. Por ejemplo, una porción significativa de los genes NLR (TNL) del receptor Toll/Interleucina-1 exhibió una expresión enriquecida en la vasculatura, mientras que esto no se observó para los NLR (CNL) y los NLR de dominio CCR en espiral en Arabidopsis tras la inoculación con el hongo. patógeno Colletotrichum higginsianum64. También se detectaron patrones distintos de expresión de genes inmunes en poblaciones celulares particulares en plantas de Arabidopsis infectadas con P. syringae virulenta y avirulenta utilizando una combinación de análisis de snRNA-seq, snATAC-seq y transcriptoma espacial (MERFISH)65. Por ejemplo, los genes implicados en la resistencia sistémica adquirida (SAR), incluidos ALD1, FMO1 e ILL6, también mostraron una expresión mejorada en las células acompañantes del floema, lo que indica que este tipo de células puede desempeñar un papel único en la regulación de la SAR y contribuir al envío de señales inmunes sistémicas65. Al desentrañar las respuestas inmunitarias específicas de cada tipo de célula, estos estudios contribuyen a una mejor comprensión de la complejidad y coordinación de las respuestas inmunitarias de las plantas.

También se han utilizado líneas indicadoras fluorescentes codificadas genéticamente que expresan marcadores inmunes en tipos de células definidos para investigar espacialmente las respuestas de las plantas16,17. Una combinación de tecnologías unicelulares FACS y SMART-seq permitió la elaboración de perfiles transcripcionales de elementos del tamiz del protofloema, elementos del tamiz del metafloema, células acompañantes y células del periciclo del polo del floema40. Un enfoque similar podría facilitar la investigación de respuestas específicas de tipos o estados de células raras durante la infección por patógenos a través de sc/snRNA-seq o ST (Fig. 2).

Un diagrama esquemático que muestra áreas de investigación representativas que pueden investigarse mediante perfiles unicelulares, uninucleares y espaciales. Una combinación de diferentes enfoques conducirá a una comprensión más completa de las interacciones entre plantas y microbios. Creado con BioRender.com.

La distribución microbiana es variable dentro y sobre el tejido vegetal66,67. Además, existen simultáneamente múltiples etapas de infección dentro de un tejido incluso en condiciones controladas. Por ejemplo, se pueden observar simultáneamente tres fases de infección distintas en una sola vaina de hoja de arroz después de la inoculación con el hongo patógeno Magnaporthe oryzae (fase necrotrófica transitoria, biotrófica temprana y tardía)4. Las esporas del hongo patógeno Zymoseptoria tritici germinan y penetran en las hojas del trigo durante 10 días, lo que provoca múltiples infecciones asincronizadas que existen simultáneamente7,68,69. La respuesta de la planta a la infección asincrónica y la orientación desigual de los efectores dará como resultado respuestas celulares heterogéneas que no pueden revelarse mediante análisis de secuenciación de ARN en masa.

No sólo la distribución de patógenos es variable dentro de un tejido, sino que los patógenos también exhiben diferencias entre células en la expresión genética durante la infección70,71,72. Por ejemplo, el patógeno bacteriano necrotrófico Dickeya dadantii exhibe heterogeneidad en la longitud celular y la expresión genética para equilibrar la virulencia y el crecimiento vegetativo durante la infección70. En Pseudomonas syringae, la expresión de los genes que codifican el sistema de secreción tipo tres muestra un patrón de expresión biestable reversible que afecta la virulencia bacteriana72. El impacto de la heterogeneidad transcripcional en poblaciones bacterianas isogénicas no se puede estudiar mediante análisis de secuenciación de ARN en masa. Los desafíos técnicos han dificultado la adaptación de la tecnología scRNA-seq a los microbios; Los ARNm procarióticos son menos abundantes y no están poliadenilados. Sin embargo, recientemente se han desarrollado varias herramientas para la secuenciación de ARN bacteriano unicelular in vitro, incluida la transcriptómica de ligadura de grupos divididos microbianos (microSPLiT), la secuenciación bacteriana basada en sondas (ProBac-seq) y el perfil de expresión procariótica mediante el etiquetado de ARN in situ. y secuenciación (PETRI-seq)73,74,75. La combinación de estas herramientas junto con métodos eficientes de aislamiento bacteriano a partir de tejido vegetal, como una centrifugación en gradiente de densidad en presencia de un reactivo protector de ARN76, podría ayudar a dilucidar respuestas microbianas heterogéneas durante la infección.

Comprender la asociación entre la distribución microbiana y la regulación espaciotemporal de las respuestas de las plantas durante la colonización sigue siendo un área que requiere mayor exploración77. La distribución espacial de comunidades bacterianas complejas en el tejido vegetal se informó recientemente utilizando una técnica novedosa llamada FISH secuencial resistente a errores (SEER-FISH)78. Cao et al.78 investigaron los patrones de colonización microbiana a lo largo de la raíz y observaron cambios en las relaciones espaciales entre diferentes taxones microbianos en comunidades sintéticas. En ambientes naturales, las plantas interactúan con diversas comunidades microbianas que exhiben una amplia gama de comportamientos, desde patógenos hasta mutualistas79. Para aplicar el método SEER-FISH a comunidades naturales, primero es necesario identificar las especies que componen la comunidad bacteriana. La reciente detección simultánea de la ubicación microbiana y las transcripciones de las plantas mediante transcriptómica espacial resalta la heterogenicidad tanto de la distribución microbiana como de las respuestas de las plantas dentro de la misma hoja9,65. Los avances futuros en ST deberían permitir la elaboración de perfiles de transcriptomas tanto de plantas como de patógenos, incluido el perfil de células adyacentes y dirigidas a patógenos (Fig. 2). Al examinar los cambios transcriptómicos que ocurren tanto en las células vegetales como en las microbianas durante la colonización, los investigadores pueden obtener una comprensión integral de las interacciones moleculares y los procesos de señalización involucrados en el establecimiento de asociaciones entre plantas y microbios.

Varios estudios recientes han destacado la importancia de las respuestas espaciotemporales de las plantas utilizando ST, scRNA-seq solo o una combinación de scRNA-seq y líneas informadoras codificadas genéticamente36,64,65,80,81,82,83,84,85,86, 87. Diferentes tipos de células en las raíces de Medicago truncatula exhibieron una expresión genética regulada diferencialmente en respuesta al simbionte bacteriano Ensifer (Sinorhizobium) meliloti36. La metabolómica unicelular también ha revelado heterogeneidad metabólica en nódulos radiculares colonizados por la bacteria simbiótica Bradyrhizobium japonicum10. La heterogeneidad celular en las interacciones planta-microbio se puede visualizar de manera temporal mediante análisis de trayectoria celular80,81,82,83,87 (Fig. 2). Por ejemplo, un perfil transcriptómico unicelular de una interacción compatible entre Arabidopsis y P. syringae82 reveló una continuidad de la progresión de la enfermedad desde un estado inmune a un estado susceptible dentro de una hoja. Además, la heterogeneidad celular en la respuesta inmune de las plantas también está regulada espacialmente. La expresión de genes inmunitarios espacialmente restringida se correlaciona con la distribución de patógenos, y las células vegetales próximas a la colonización de patógenos exhiben una expresión de genes inmunitarios más fuerte9,64,65,82,88. P. syringae ingresa al apoplasto de la planta a través de aberturas naturales como los estomas y se acumula en las cavidades subestomáticas. Zhu et al.82 encontraron que la expresión del marcador inmunológico FRK1 estaba altamente inducida en las células que rodean estas cavidades colonizadas por P. syringae. Además, en Arabidopsis, Liu et al.88 observaron dos picos sucesivos de respuestas transcriptómicas durante la ETI inducida por el efector AvrRpt2. Estos picos representaban diferentes poblaciones celulares con distintos patrones de expresión genética. El primer pico correspondió a células que respondieron de forma autónoma a AvrRpt2, lo que indica una respuesta inmune localizada. El segundo pico consistió en células que rodeaban a la población que respondió inicialmente, lo que sugiere una respuesta coordinada en las células vecinas. Los avances futuros que utilicen una combinación de enfoques espaciales unicelulares y de alta resolución proporcionarán mayores conocimientos sobre la heterogeneidad celular y la dinámica espaciotemporal que se producen durante las interacciones entre plantas y microbios.

Las características distintivas de las respuestas inmunes de las plantas (ROS, Ca2+, producción de DAMP) actúan como importantes moléculas de señalización para la comunicación entre células89. La reprogramación global de los tejidos vegetales para la defensa compromete el crecimiento de las plantas90. Durante la infección natural, las plantas deben poder restringir la infección por patógenos sin reprogramar completamente tejidos enteros. Las plantas pueden compartimentar las respuestas de defensa restringiendo espacialmente las respuestas inmunes dentro de una hoja a unas pocas capas de células a través de una resistencia local adquirida (LAR)91,92. Tanto las líneas indicadoras transcripcionales como la transcriptómica espacial han revelado respuestas inmunes de las hojas de Arabidopsis espacialmente restringidas alrededor de colonias bacterianas tras la activación de ETI65,82,92,93,94,95. Además, tres líneas inmunes reporteras adicionales demostraron la expresión de transcripciones inmunes en un patrón circular de varias capas celulares muy próximas a las colonias de P. syringae después de la inoculación en la superficie82. La expresión de genes de defensa de las plantas y la abundancia microbiana también exhiben correlaciones espaciales tanto en Arabidopsis cultivada al aire libre como en Arabidopsis inoculada en cámara de crecimiento utilizando ST9,65.

A pesar de los importantes avances en las técnicas unicelulares, persisten desafíos al estudiar las interacciones dinámicas entre dos o más organismos. Por ejemplo, identificar, aislar y perfilar células vegetales invadidas por patógenos sigue siendo un desafío. La interacción física entre las células vegetales y el patógeno se elimina después del aislamiento de los núcleos. Se necesitan avances en ST y estrategias para etiquetar las células infectadas en contacto directo con el patógeno. Estos avances facilitarán la comprensión de cómo las células vegetales atacadas por patógenos se comunican con sus vecinas. También será importante perfilar la señalización celular en respuesta a diferentes patógenos en diferentes etapas de la infección en diferentes tipos de tejidos en genotipos de plantas para obtener una comprensión holística del repertorio de cómo las plantas responden a la infección por patógenos.

El perfil transcripcional simultáneo tanto de la planta como del patógeno sigue siendo un desafío en la resolución celular. Las plantas, así como los patógenos, exhiben heterogeneidad en sus respuestas. La tecnología actual captura transcripciones de eucariotas poliadeniladas para la preparación de bibliotecas de secuenciación. Este paso inhibe la captura de la mayoría de las transcripciones bacterianas y virales. Para capturar miles de células o núcleos, la mayoría de los estudios recolectan tejido de múltiples plantas agrupadas, lo que enmascara la variación entre plantas. Otros desafíos incluyen el costo, el análisis de datos y la integración96. Esto es similar a las primeras etapas de la elaboración de perfiles transcripcionales utilizando microarrays y RNA-seq. El desarrollo de métodos de alto rendimiento con costo reducido para ST, unicelular y snRNA-seq facilitará un uso más amplio de estos enfoques.

Durante las interacciones planta-microbio, las plantas han desarrollado una comunicación entre células finamente regulada para combatir la exposición constante a desafíos microbianos89. El análisis unicelular se ha utilizado para investigar la comunicación entre células en las células de la raíz de las plantas y detectar señales abióticas y de desarrollo, pero aún no en las interacciones entre plantas y microbios97,98. Con el desarrollo de técnicas espaciales, la transcriptómica resuelta espacialmente facilitará la comprensión de la comunicación entre células9,65. Además, la incorporación de coordenadas espaciales en la trayectoria de una célula puede resolver diferencias con los datos generados a partir de células disociadas46.

Las investigaciones futuras que utilicen tecnologías espaciales con resolución unicelular permitirán una comprensión más completa de cómo las células vegetales pueden comunicarse con sus vecinas e inducir respuestas de defensa sólidas pero espacialmente restringidas. La identificación de factores transcripcionales y transcripciones que están enmascarados en análisis masivos ha permitido la construcción de redes reguladoras de genes (GRN) con resolución unicelular36,39,81. La próxima frontera en las interacciones entre plantas y microbios requerirá la integración de múltiples enfoques ómicos con resolución espacial y celular, incluidos el transcriptoma, el epigenoma, el metaboloma y el proteoma65,99 (Fig. 2). Los análisis integrados que utilizan multiómicas unicelulares y ómicas espaciales brindarán la oportunidad de investigar de manera integral las respuestas celulares específicas, así como revelar el panorama de la capacidad de respuesta de plantas y patógenos con resolución espacial22,65. Las hipótesis generadas a partir de dichos análisis pueden luego probarse experimentalmente en el contexto de diferentes interacciones entre plantas y patógenos. En última instancia, una comprensión de alta resolución de cómo responden las plantas a diversos patógenos identificará nuevos mecanismos reguladores que pueden aprovecharse para un control más eficaz de las enfermedades.

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Descargar referencias

Agradecemos a los miembros del Laboratorio Coaker, Benjamin Cole y Tatsuya Nobori por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [número de subvención R35GM136402] para GCAM-P. Fue apoyado por una beca postdoctoral de la Fundación Alfonso Martín Escudero.

Estos autores contribuyeron igualmente: Jie Zhu, Alba Moreno-Pérez.

Departamento de Fitopatología, Universidad de California, Davis, One Shields Avenue, Davis, CA, 95616, EE. UU.

Jie Zhu, Alba Brown-Pérez y Gitta Coaker

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Todos los autores contribuyeron a la redacción del manuscrito y las ideas presentadas. GC dirigió la estructura y finalizó la redacción. JZ generó las Figs. 1 y 2.

Correspondencia a Gitta Coaker.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Andre Velásquez y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Shahid Mukhtar, George Inglis.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Zhu, J., Moreno-Pérez, A. & Coaker, G. Comprensión de las interacciones entre patógenos vegetales utilizando tecnologías espaciales y unicelulares. Común Biol 6, 814 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05156-8

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Recibido: 07 de abril de 2023

Aceptado: 18 de julio de 2023

Publicado: 04 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05156-8

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